在液相色谱（LC）和亲和色谱中，填料的表面官能团决定了其分离选择性、保留机制和应用范围。氨基（NH2）和酰胺基（Amide）是两种常见的色谱填料修饰基团，它们在结构、化学性质及适用场景上存在显著差异。
一、结构区别
（1）氨基（NH2）填料
氨基填料通常是在硅胶或聚合物基质表面键合伯胺基团（—NH₂），如氨丙基硅烷（如 NH₂-Silica）。
l 氮原子带有孤电子对，呈碱性（pKa ~9-10）。
l 可与酸性化合物（如羧酸、酚类）发生离子相互作用。
常见类型：
l HILIC（亲水相互作用色谱）填料（用于极性化合物分离）。
l 阴离子交换填料（在低pH下带正电，可交换阴离子）。
（2）酰胺基（Amide）填料
酰胺基填料通常是在硅胶或聚合物表面键合酰胺基团（—CONH₂），如 Amide-HILIC 填料。
l 羰基（C=O）和氨基（—NH）共同作用，形成氢键受体和供体。
l 氮的孤电子对与羰基共轭，使其呈中性或弱极性。
常见类型：
l HILIC 酰胺柱（用于糖类、多肽等极性分子分离）。
l 反相/亲水混合模式填料（如 C18-Amide）。
二、化学性质对比
性质 | 氨基（—NH₂）填料 | 酰胺基（—CONH₂）填料 |
酸碱性 | 碱性（可质子化，pKa ~9-10） | 中性（无显著酸碱性） |
氢键能力 | 中等（可作为氢键供体） | 强（兼具氢键供体和受体） |
离子交换能力 | 可进行阴离子交换（低pH下带正电） | 无离子交换能力 |
稳定性 | 易氧化，长期使用可能降解 | 更稳定，耐水解 |
极性 | 高（适用于HILIC模式） | 高（适用于HILIC及极性化合物） |
三、分离机制
（1）氨基（NH2）填料的保留机制
HILIC 模式：
l 通过氢键和偶极-偶极作用保留极性化合物（如糖类、核苷酸）。
l 在高有机相（乙腈/甲醇）中增强亲水相互作用。
阴离子交换（AX）：
l 在pH <7时，—NH₃⁺可吸附阴离子（如磷酸根、有机酸）。
（2）酰胺基（Amide）填料的保留机制
HILIC 模式：
l 主要依赖氢键和极性相互作用，比—NH₂填料更稳定。
l 适合强极性化合物（如糖类、多肽、代谢物）。
反相/亲水混合模式：
l 部分酰胺柱（如 C18-Amide）兼具反相和HILIC特性，适用于复杂样品。
四、 应用案例
（1）氨基（NH2）填料的应用
糖类分析（HILIC模式）
l 例：单糖、二糖（葡萄糖、蔗糖）的分离，因—NH₂可与羟基形成 氢键。
l 色谱条件：乙腈/水（80:20），UV或ELSD检测。
阴离子交换（AX）纯化核苷酸
l 例：ATP、ADP的纯化，在pH 4.5时—NH₃⁺吸附磷酸基团。
碱性化合物分离
l 例：儿茶酚胺（如肾上腺素）在HILIC模式下的分析。
（2）酰胺基（Amide）填料的应用
极性代谢物分析（HILIC模式）
l 例：LC-MS分析氨基酸、核苷酸，酰胺柱提供更好的峰形和重现性。
糖蛋白/糖肽富集
l 例：在糖蛋白质组学中，酰胺柱可选择性保留糖基化肽段。
反相/HILIC混合模式分离
l 例：C18-Amide柱分离疏水（如苯系物）和亲水化合物（如糖类）。
五、选择指南
分离产品 | 推荐填料 | 推荐原因 |
糖类、核苷酸分离 | 酰胺基（—CONH₂） | 更稳定，氢键能力强 |
阴离子交换（AX）纯化 | 氨基（—NH₂） | 可质子化，吸附阴离子 |
极性代谢物LC-MS分析 | 酰胺基（—CONH₂） | 低吸附，高回收率 |
复杂极性样品（如中药） | C18-Amide混合柱 | 兼具反相和HILIC特性 |
六、
氨基（NH2）填料：适合阴离子交换和HILIC分离，但稳定性较差，易受pH影响。
酰胺基（Amide）填料：更适合极性化合物的HILIC分析，稳定性高，氢键能力强。
在实际应用中，需根据目标化合物的极性、酸碱性及分离模式选择合适的填料。对于复杂样品（如生物代谢组学），酰胺基填料通常表现更优，而氨基填料在阴离子交换纯化中仍具有独特优势。